Физико-химические свойства белков
Молекулярный вес белков
Молекулярный вес белков не может быть определен методами классической химии (например, депрессией точки замерзания), поскольку для этого требуются растворы более высокой концентрации белка, чем можно приготовить.
Купить ультразвуковой анализатор качества молока Лактан вы можете у нас с гарантией 2 года
Если белок содержит только одну молекулу одной из аминокислот или один атом железа, меди или другого элемента, можно рассчитать минимальный молекулярный вес белка или субъединицы; например, белок миоглобин содержит 0,34 грамма железа в 100 граммах белка.
Атомный вес железа равен 56; таким образом, минимальный молекулярный вес миоглобина составляет (56×100)/0,34 = около 16 500. Прямые измерения молекулярного веса миоглобина дают такое же значение. Однако молекулярный вес гемоглобина, который также содержит 0,34 процента железа, составляет 66 000 или 4×16 500; таким образом, гемоглобин содержит четыре атома железа.
Для определения молекулярного веса белков чаще всего используется метод ультрацентрифугирования —
Форма белковых молекул
В технике дифракции рентгеновских лучей рентгеновские лучи попадают на кристалл белка. Рентгеновские лучи, дифрагированные (изогнутые) кристаллом, попадают на фотопластинку, образуя узор из пятен. Этот метод показывает, что пептидные цепи могут иметь очень сложную, на первый взгляд неправильную форму. Два крайних варианта формы включают тесно свернутую структуру глобулярных белков и вытянутую, одномерную структуру нитевидных волокнистых белков; обе эти формы были признаны за много лет до разработки метода рентгеновской дифракции. Растворы волокнистых белков чрезвычайно вязкие (т.е. липкие); растворы глобулярных белков имеют низкую вязкость (т.е. легко текут). 5-процентный раствор глобулярного белка — например, овальбумина — легко проходит через узкую стеклянную трубку; 5-процентный раствор желатина, волокнистого белка, однако, не проходит через трубку, потому что он жидкий только при высоких температурах и застывает при комнатной температуре.
Даже растворы, содержащие всего 1 или 2 процента желатина, обладают высокой вязкостью и текут через узкую трубку либо очень медленно, либо только под давлением.
Можно представить, что удлиненные пептидные цепи волокнистых белков запутываются не только механически, но и за счет взаимного притяжения боковых цепей, и таким образом они вбирают в себя большое количество воды. Однако большинство гидрофильных (притягивающих воду) групп глобулярных белков находятся на поверхности молекул, и в результате глобулярные белки вбирают в себя лишь несколько молекул воды.
Если раствор волокнистого белка протекает через узкую трубку, вытянутые молекулы становятся ориентированными параллельно направлению потока, и раствор становится двулучепреломляющим, как кристалл;
Растворы миозина, сократительного белка мышц, показывают очень высокое двулучепреломление потока; другие белки с очень высоким двулучепреломлением потока включают растворы фибриногена, свертывающего материала плазмы крови, и растворы вируса табачной мозаики. Гамма-глобулины плазмы крови демонстрируют низкое двулучепреломление потока, а в растворах сывороточного альбумина и овальбумина его не наблюдается.
Гидратация белков
Когда сухие белки подвергаются воздействию воздуха с высоким содержанием воды, они быстро связывают воду до максимального количества, которое отличается для разных белков; обычно оно составляет от 10 до 20 процентов от веса белка. Гидрофильные группы белка — это главным образом положительно заряженные группы в боковых цепях лизина и аргинина и отрицательно заряженные группы аспаргиновой и глутаминовой кислоты. Гидратация (т.е. связывание воды) может также происходить на гидроксильных (-OH) группах серина и треонина или на амидных (-CONH2) группах аспарагина и глутамина.
Связывание молекул воды с заряженными или полярными (частично заряженными) группами объясняется диполярной структурой молекулы воды, то есть два положительно заряженных атома водорода образуют угол около 105°, а отрицательно заряженный атом кислорода находится в вершине.
Центр положительных зарядов расположен между двумя атомами водорода; центр отрицательного заряда атома кислорода находится в вершине угла. Отрицательный полюс диполярной молекулы воды связывается с положительно заряженными группами; положительный полюс связывает отрицательно заряженные группы. Отрицательный полюс молекулы воды также связывается с гидроксильными и аминогруппами белка.
Вода гидратации необходима для структуры белковых кристаллов; когда они полностью обезвоживаются, кристаллическая структура распадается. У некоторых белков этот процесс сопровождается денатурацией и потерей биологической функции.
В водных растворах белки связывают некоторые молекулы воды очень прочно, другие же связаны очень слабо или образуют островки молекул воды между петлями свернутых пептидных цепей. Поскольку считается, что молекулы воды в таком островке ориентированы как во льду, который представляет собой кристаллическую воду, островки воды в белках называют айсбергами.
Молекулы воды также могут образовывать мостики между карбонильными и иминогруппами соседних пептидных цепей, в результате чего образуются структуры, похожие на плиссированный лист, но с молекулой воды в положении водородных связей такой конфигурации. Степень гидратации белковых молекул в водных растворах важна, поскольку некоторые из методов, используемых для определения молекулярной массы белков, дают молекулярную массу гидратированного белка. Количество воды, связанной с одним граммом глобулярного белка в растворе, варьируется от 0,2 до 0,5 грамма. Гораздо большее количество воды механически иммобилизуется между удлиненными пептидными цепями волокнистых белков; например, один грамм желатина может иммобилизовать при комнатной температуре от 25 до 30 граммов воды.
Гидратация белков необходима для их растворимости в воде. Если вода гидратации растворенного в воде белка уменьшается при добавлении соли, такой как сульфат аммония, белок перестает быть растворимым и высаливается, или выпадает в осадок. Процесс высаливания обратим, поскольку белок не денатурируется (т.е. необратимо превращается в нерастворимый материал) при добавлении таких солей, как хлорид натрия, сульфат натрия или сульфат аммония. Некоторые глобулины, называемые эуглобулинами, нерастворимы в воде в отсутствие солей; их нерастворимость объясняется взаимным взаимодействием полярных групп на поверхности соседних молекул, что приводит к образованию больших агрегатов молекул. Добавление небольшого количества соли приводит к тому, что эуглобулины становятся растворимыми. Этот процесс, называемый высаливанием, происходит в результате сочетания анионов (отрицательно заряженных ионов) и катионов (положительно заряженных ионов) соли с положительно и отрицательно заряженными боковыми цепями эуглобулинов. Эта комбинация предотвращает агрегацию молекул эуглобулина, препятствуя образованию солевых мостиков между ними. Добавление большего количества сульфата натрия или аммония приводит к повторному высаливанию эуглобулинов и выпадению осадка.
Электрохимия белков
Поскольку α-аминогруппа и α-карбоксильная группа аминокислот преобразуются в пептидные связи в молекуле белка, в данной молекуле белка имеется только одна α-аминогруппа (на N-конце) и одна α-карбоксильная группа (на С-конце). Эти две группы очень мало влияют на электрохимический характер белка. Однако большое значение имеют многочисленные положительно заряженные аммониевые группы (-NH3+) лизина и аргинина и отрицательно заряженные карбоксильные группы (-COO-) аспаргиновой и глутаминовой кислот. В большинстве белков количество положительно и отрицательно заряженных групп варьируется от 10 до 20 на 100 аминокислот.
Электрометрическое титрование
Когда к раствору белка в бессолевой воде добавляют отмеренный объем соляной кислоты, рН уменьшается пропорционально количеству добавленных ионов водорода до значения около 4. Дальнейшее добавление кислоты вызывает гораздо меньшее снижение рН, поскольку белок действует как буфер при значениях рН от 3 до 4. Реакция, происходящая в этом диапазоне рН, заключается в протонировании карбоксильной группы —
Электрометрическое титрование изоэлектрического белка гидроксидом калия вызывает очень медленное увеличение pH и слабое буферное действие белка при pH 7; очень сильное буферное действие происходит в диапазоне pH от 9 до 10. Буферное действие при pH 7, которое вызвано потерей протонов (положительно заряженного водорода) из имидазолиевых групп (т.е. пятичленной кольцевой структуры в боковой цепи) гистидина, является слабым, поскольку содержание гистидина в белках обычно низкое.
Гораздо более сильное буферное действие при значениях pH от 9 до 10 обусловлено потерей протонов из гидроксильной группы тирозина и из аммониевых групп лизина. Наконец, протоны теряются из гуанидиниевых групп (т.е. азотсодержащих терминальных частей боковых цепей аргинина) аргинина при pH 12. Электрометрическое титрование белков дает аналогичные кривые. Электрометрическое титрование позволяет определить приблизительное количество карбоксильных групп, аммониевых групп, гистидинов и тирозинов на молекулу белка.
Электрофорез
Положительно и отрицательно заряженные боковые цепи белков заставляют их вести себя в электрическом поле подобно аминокислотам, то есть они мигрируют во время электрофореза при низких значениях pH к катоду (отрицательному полюсу), а при высоких значениях pH — к аноду (положительному полюсу). Изоэлектрическая точка, значение pH, при котором молекула белка не мигрирует, для многих белков находится в диапазоне от pH 5 до 7. Такие белки, как лизоцим, цитохром c, гистон и другие, богатые лизином и аргинином, имеют изоэлектрические точки в диапазоне pH от 8 до 10. Изоэлектрическая точка пепсина, который содержит очень мало основных аминокислот, близка к 1.
Свободно-граничный электрофорез, первоначальный метод определения электрофоретической миграции, во многих случаях был заменен зонным электрофорезом, при котором белок помещается либо в гель из крахмала, агара или полиакриламида, либо в пористую среду, такую как бумага или ацетат целлюлозы. Миграцию гемоглобина и других окрашенных белков можно проследить визуально. Бесцветные белки становятся видимыми после завершения электрофореза путем окрашивания их подходящим красителем.
Конформация глобулярных белков
Большинство знаний о вторичной и третичной структуре глобулярных белков было получено при исследовании их кристаллов с помощью дифракции рентгеновских лучей. В этом методе рентгеновские лучи попадают на кристалл; рентгеновские лучи дифрагируют на кристалле и попадают на фотопластинку, образуя картину пятен. Измеренная интенсивность дифракционной картины, записанная на фотопленке, зависит, в частности, от электронной плотности атомов в кристалле белка. Эта плотность наименьшая у атомов водорода, и они не дают видимой дифракционной картины.
Хотя атомы углерода, кислорода и азота дают видимую дифракционную картину, они присутствуют в таком большом количестве — около 700 или 800 на 100 аминокислот — что разрешение структуры белка, содержащего более 100 аминокислот, практически невозможно. Разрешение значительно улучшается при замене в боковых цепях некоторых аминокислот очень тяжелых атомов, особенно атомов тяжелых металлов. Ионы ртути, например, связываются с сульфгидрильными (-SH) группами цистеина. В других белках использовался хлорид платины. В железосодержащих белках адекватным является атом железа, уже имеющийся в молекуле.
Хотя метод рентгеновской дифракции не может разрешить полную трехмерную конформацию (то есть вторичную и третичную структуру пептидной цепи), полное разрешение было получено путем объединения результатов рентгеновской дифракции с результатами анализа аминокислотной последовательности. Таким образом была получена полная конформация таких белков, как миоглобин, химотрипсиноген, лизоцим и рибонуклеаза.
Метод рентгеновской дифракции позволил обнаружить в белках регулярную структурную организацию; одна из них представляет собой вытянутую форму антипараллельных пептидных цепей, которые связаны друг с другом водородными связями между карбонильными и иминогруппами. Эта конформация, называемая плиссированным листом, или β-структурой, встречается в некоторых волокнистых белках. Короткие нити β-структуры также были обнаружены в некоторых глобулярных белках.
Второй важной структурной схемой является α-спираль; она образована последовательностью аминокислот, закрученных вокруг прямой оси в правостороннюю или левостороннюю спираль. Каждый виток спирали соответствует расстоянию в 5,4 ангстрема (= 0,54 нанометра) в направлении оси винта и содержит 3,7 аминокислоты. Следовательно, длина α-спирали на один аминокислотный остаток равна 5,4, деленная на 3,7, или 1,5 ангстрема (1 ангстрем = 0,1 нанометра).
Стабильность α-спирали поддерживается водородными связями между карбонильными и иминогруппами соседних витков спирали. Раньше, на основании данных анализа молекулы миоглобина, более половины которой состоит из α-спиралей, считалось, что α-спираль является преобладающим структурным элементом глобулярных белков; теперь известно, что миоглобин в этом отношении исключителен.
Другие глобулярные белки, структуры которых были определены с помощью рентгеновской дифракции, содержат лишь небольшие участки α-спирали. В большинстве из них пептидные цепи сложены, по-видимому, случайным образом, для чего был использован термин «случайная спираль». Однако этот термин вводит в заблуждение, поскольку сворачивание не является случайным; скорее, оно диктуется первичной структурой и изменяется вторичной и третичной структурами.
Первыми белками, для которых внутренние структуры были полностью разрешены, стали железосодержащие белки миоглобин и гемоглобин. Исследование гидратированных кристаллов этих белков британским биохимиком австрийского происхождения Максом Перутцем и британским биохимиком Джоном К. Кендрю, получившими за свою работу Нобелевскую премию по химии 1962 года, показало, что складывание пептидных цепей настолько плотное, что большая часть воды вытесняется из центра глобулярных молекул. Аминокислоты, несущие аммониевые (-NH3+) и карбоксильные (-COO-) группы, были смещены к поверхности глобулярных молекул, а неполярные аминокислоты были сосредоточены внутри.
Другие подходы к определению структуры белков
Ни один из нескольких других физических методов, которые использовались для получения информации о вторичной и третичной структуре белков, не дает столько прямой информации, как метод рентгеновской дифракции. Однако большинство этих методов намного проще, чем рентгеновская дифракция, которая требует для разрешения структуры одного белка многих лет работы и оборудования, такого как электронно-вычислительные машины. Некоторые из более простых методов основаны на оптических свойствах белков — преломлении, поглощении света различных длин волн, вращении плоскости поляризованного света на различных длинах волн и люминесценции.
Спектрофотометрическое поведение
Спектрофотометрия белковых растворов (измерение степени поглощения света белком в пределах определенной длины волны) полезна в диапазоне видимого света только для белков, которые содержат окрашенные простетические группы (небелковые компоненты). Примерами таких белков являются красные белки гема крови, фиолетовые пигменты сетчатки глаза, зеленые и желтые белки, содержащие желчные пигменты, синие медьсодержащие белки и темно-коричневые белки, называемые меланинами.
Пептидные связи, благодаря своим карбонильным группам, поглощают световую энергию на очень коротких длинах волн (185−200 нанометров). Ароматические кольца фенилаланина, тирозина и триптофана поглощают ультрафиолетовый свет в диапазоне длин волн от 280 до 290 нанометров. Поглощение ультрафиолетового света триптофаном наибольшее, тирозином — меньшее, а фенилаланином — наименьшее. Если содержание тирозина или триптофана в белке известно, то концентрация раствора белка может быть определена путем измерения его поглощения между 280 и 290 нанометрами.
Оптическая активность
Напомним, что аминокислоты, за исключением глицина, проявляют оптическую активность (вращение плоскости поляризованного света; см. выше Физико-химические свойства аминокислот). Поэтому неудивительно, что белки также оптически активны. Они обычно леворотируют (т.е. вращают плоскость поляризации влево), когда используется поляризованный свет с длиной волны в видимом диапазоне. Хотя удельное вращение (функция концентрации белкового раствора и расстояния, которое проходит свет в нем) большинства L-аминокислот варьируется от -30° до +30°, аминокислота цистин имеет удельное вращение приблизительно -300°. Хотя оптическое вращение белка зависит от всех аминокислот, из которых он состоит, наиболее важными из них являются цистин и ароматические аминокислоты фенилаланин, тирозин и триптофан. Вклад остальных аминокислот в оптическую активность белка пренебрежимо мал.
Химическая реакционная способность белков
Информация о внутренней структуре белков может быть получена с помощью химических методов, которые показывают, присутствуют ли определенные группы на поверхности белковой молекулы и, следовательно, способны вступать в реакцию, или они находятся внутри тесно сложенных пептидных цепей и, следовательно, не способны вступать в реакцию. Химические реагенты, используемые в таких исследованиях, должны быть мягкими, не влияющими на структуру белка.
Особый интерес представляет реакционная способность тирозина. Например, было обнаружено, что только три из шести тирозинов, содержащихся в природном ферменте рибонуклеазе, могут быть йодированы (т.е. вступить в реакцию с атомом йода). Катализируемое ферментом разрушение йодированной рибонуклеазы используется для идентификации пептидов, в которых присутствуют йодированные тирозины. Три тирозина, которые могут быть йодированы, находятся на поверхности рибонуклеазы; остальные, которые считаются недоступными, как говорят, похоронены в молекуле. Тирозин можно идентифицировать и с помощью других методов — например, обработкой соединениями диазония или тетранитрометаном. Поскольку образующиеся соединения окрашены, их легко обнаружить при расщеплении белка ферментами.
Цистеин может быть обнаружен путем соединения с такими соединениями, как йодоуксусная кислота или йодоацетамид; в результате реакции образуется карбоксиметилцистеин или карбамидометилцистеин, которые могут быть обнаружены путем аминокислотного определения содержащих их пептидов. Имидазольные группы некоторых гистидинов также могут быть обнаружены путем соединения с теми же реагентами в различных условиях. К сожалению, немногие другие аминокислоты могут быть мечены без изменения вторичной и третичной структуры белка.
Ассоциация белковых субъединиц
Многие белки с молекулярной массой более 50 000 встречаются в водных растворах в виде комплексов: димеров, тетрамеров и высших полимеров —
Денатурация белка
Когда раствор белка кипятят, белок часто становится нерастворимым —
Денатурация может быть вызвана различными способами. Белки денатурируются при обработке щелочью или кислотой, окисляющими или восстанавливающими агентами, а также некоторыми органическими растворителями. Среди денатурирующих агентов интересны те, которые влияют на вторичную и третичную структуру, не затрагивая первичную. Наиболее часто для этой цели используются мочевина и хлорид гуанидиния. Эти молекулы, благодаря своему высокому сродству к пептидным связям, разрушают водородные связи и солевые мостики между положительными и отрицательными боковыми цепями, тем самым упраздняя третичную структуру пептидной цепи. Когда денатурирующие агенты удаляются из раствора белка, нативный белок во многих случаях восстанавливается.
Денатурация также может быть осуществлена путем восстановления дисульфидных связей цистина —
Однако некоторые из малых белков чрезвычайно устойчивы даже к нагреванию; например, растворы рибонуклеазы можно подвергать кратковременному воздействию температуры 90 °C (194 °F) без существенной денатурации. Денатурация не сопровождается идентичными изменениями в белковых молекулах. Однако общим свойством денатурированных белков является потеря биологической активности — например, способности действовать как ферменты или гормоны.
Хотя денатурация долгое время считалась реакцией «все или ничего», сейчас считается, что между нативным и денатурированным белком существует множество промежуточных состояний. В некоторых случаях, однако, за разрывом ключевой связи может последовать полное разрушение конформации нативного белка.
Хотя многие нативные белки устойчивы к действию фермента трипсина, который расщепляет белки в процессе пищеварения, они гидролизуются тем же ферментом после денатурации. Пептидные связи, которые могут быть расщеплены трипсином, недоступны в нативных белках, но становятся доступными при денатурации. Аналогично, денатурированные белки дают более интенсивные цветные реакции на тирозин, гистидин и аргинин, чем те же белки в нативном состоянии. Повышенная доступность реактивных групп денатурированных белков объясняется разворачиванием пептидных цепей.
Если денатурация происходит легко, а ренатурация — трудно, то как сохраняется нативная конформация глобулярных белков в живых организмах, в которых они образуются поэтапно, путем присоединения одной аминокислоты за раз? Эксперименты по биосинтезу белков из аминокислот, содержащих радиоактивный углерод или тяжелый водород, показывают, что молекула белка растет поэтапно от N-конца к С-концу; на каждом этапе в нее включается один остаток аминокислоты.
Как только растущая пептидная цепь содержит шесть или семь аминокислотных остатков, боковые цепи взаимодействуют друг с другом, вызывая отклонения от прямой или β-цепной конфигурации. В зависимости от природы боковых цепей, это может привести к образованию α-спирали или петель, закрытых водородными связями или дисульфидными мостиками. Окончательная конформация, вероятно, застывает, когда длина пептидной цепи достигает 50 или более аминокислотных остатков.
Конформация белков в интерфейсах
Как и многие другие вещества с гидрофильными и гидрофобными группами, растворимые белки имеют тенденцию мигрировать на границу раздела воздух-вода или масло-вода; термин масло здесь означает гидрофобную жидкость, такую как бензол или ксилол. На границе раздела белки растекаются, образуя тонкие пленки. Измерения поверхностного натяжения, или межфазного натяжения, таких пленок показывают, что натяжение снижается за счет белковой пленки. Белки, образуя межфазную пленку, присутствуют в виде мономолекулярного слоя —
Движение молекул белка на границе раздела воздух-вода использовалось для определения молекулярного веса белков. Метод заключается в измерении силы, оказываемой слоем белка на барьер.
Когда раствор белка энергично встряхивают на воздухе, он образует пену, поскольку растворимые белки мигрируют на границу раздела воздух-вода и остаются там, предотвращая или замедляя повторное превращение пены в однородный раствор. Некоторые из нестабильных, легко модифицируемых белков денатурируются при распространении на границе раздела воздух-вода. Образование постоянной пены при энергичном перемешивании яичного белка является примером необратимой денатурации при растекании по поверхности.
